实验一：微生物的实验室培养

一、 实验原理

大肠杆菌是革兰氏阴性、兼性厌氧的肠道杆菌。微生物接种的方法有很多， 常用的是平板划线法和稀释涂布平板法。

平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。

稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落。

二、实验目的

1、掌握用平板划线法分离纯化大肠杆菌的方法；

2、掌握用稀释涂布平板法分离纯化大肠杆菌的方法。

三、仪器与用具

高压灭菌锅，超净工作台，接种环，培养皿，酒精灯，试管，玻璃涂布器，pH试纸，微量可调移液器，恒温培养箱，大肠杆菌，微生物的实验室培养试剂盒。

四、试剂配制

培养基配制：倒取微生物试剂盒中的一瓶固体培养基33g加入800mL蒸馏水中，加热充分溶解（调节pH 6.8±2），定容至1000mL，分装至锥形瓶，牛皮纸或透气膜包扎瓶口，121℃高压灭菌20min，取出，冷却至60-70℃分装倒平板，每个平板约15-20mL，备用。

五、实验步骤

1、倒平板操作：

⑴将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手打开封口膜。

⑵右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。

⑶用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基（约18mL）倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。

⑷等待平板冷却凝固，大约需要5～10min。然后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。

2、平板划线操作：

⑴将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红；

⑵在火焰旁冷却接种环，并打开试管冒；

⑶将试管口通过火焰；

⑷将已冷却的接种环深入菌液中，沾取一环菌液。

⑸将试管口通过火焰，并盖上试管冒。

⑹左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速深入平板内，划三到五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。

⑺灼烧接种环，待其冷却后，从 区域划线的末端开始往第二区域内划线。

重复以上操作，在三、四区域内划线。注意不要将 一区的划线与 区相连。

3、系列稀释操作：

⑴将分别盛有4.5mL水的5支试管灭菌，并按101～105的顺序编号。

⑵用移液管吸取0.5mL培养的菌液，注入第二支试管中。吹吸三次，使菌液与水充分混匀。

⑶从101倍稀释的试管中吸取0.5mL稀释液，注入102倍稀释的试管中，重复第2步的操作。依次类推，直到完成 一只试管的稀释。

4、涂布平板操作：

⑴用火焰灼烧涂布器灭菌，然后冷却8～10s。

⑵取少量菌液（0.1mL）,滴加到培养基表面。

⑶用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。

六、实验结果与分析

如图1和2所示，大肠杆菌通过划线和平板稀释涂布的方法而分离， 终得到大肠杆菌的单菌落。

【注意事项】

1.实验操作过程中在无菌超净工作台中进行，严格控制无菌环境；

进行大肠杆菌平板划线分离培养时，1区到2区的划线，只能有一处引入，其他位置不可有所接触，同理，第4区位置不能与1区有接触。