实验二：土壤中微生物的分离培养与计数

（一）牛肉膏蛋白胨固体培养基

秤取：准确秤取上述各种成分，秤取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。

溶化：先将牛肉膏量筒称量纸一同放入烧杯，加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加自来水定容至1000 mL。

调节pH：使用pH计，以1mol/L的NaOH或1mol/L的HCl调节pH至7.0~7.2.

分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶上，以免沾污棉塞而引起污染。分装锥形瓶的量以不超过瓶容量的一半为宜。

（二）高氏1号培养基

配制时，先用少量冷水将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其它成分，溶化后，补足水分至1000 mL。121℃灭菌20 min。

（三）查氏培养基

制法：加热溶解，分类后121℃灭菌20 min。

2. 器具和培养基的灭菌

将配制好的培养基放入锥形瓶中（瓶口加棉塞，包上报纸），连同培养皿、接种针、分装在玻璃试管中的纯水、涂布器、锥形瓶、80%乳胶、小铁铲、信封等用几层报纸包好，一起放到高压锅内，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌20min。

3. 倒平板

在酒精灯附近，待培养基冷却到55℃左右倒平板。查氏培养基倒平板前需另外加入1 mL80%乳酸/1000 mL，高氏1号培养基在倒平板前需另外加入4 mL10%酚液/1000 mL。

4. 土壤取样

于肥沃、湿润的土壤，铲去表层土5cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

5. 土壤样品的稀释

制备土壤悬浮液：秤取土样10 g，迅速倒入带玻璃珠的90 mL无菌水瓶中（玻璃珠用量以充满瓶底 ），震荡5~10min，使土样充分打散，即配成10-1稀释度的土壤悬浮液。用无菌移液管吸10-1的土样悬浮液1 mL，放入9 mL无菌水中即得到10-2稀释液，如此重复，可依制成10-2~10-6的稀释土壤悬浮液。

6. 微生物分离与纯化—涂布平板法

吸取上述稀释度为10-2、10-3、10-6的土壤悬浮液1 mL，通过涂布平板法分别接种到查氏培养基、高氏1号培养基、牛肉膏蛋白胨培养基中，用于霉菌、放线菌、细菌的分离与纯化。

7. 恒温箱中微生物的培养

将接种和一个未接种的空白对照培养皿倒置放入恒温箱中，于28~30℃中恒温培养：细菌培养1~2天，放线菌培养5~7天，霉菌培养3~5天。

8. 微生物菌落形态的观察和计数

微生物菌落形态可以直接通过肉眼观察，记录并描述菌落的大小、形态、边缘、光泽、质地、颜色和透明程度等形态特征。在进行恒温培养时，每隔24小时统计一次菌落数目。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中微生物的数目，具体计算公式见下：

每克样品中的菌数=（C/V）×M

C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。

V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积。

M：稀释的倍数。

四、实验结果