实验六：基因的体外扩增及电泳鉴定

（1）在0.5mL（0.2ml）离心管中加入下列成份：

（1）将加入的PCR各种成分吹打混匀后，离心管瞬时离心数秒，放入PCR仪中，按照下列反应程序进行PCR扩增实验：

     95℃预变性30 sec

     95℃ 变性  10 sec

     52℃ 退火  10 sec      25个循环    72℃ 再延伸  30sec    约27min

     72℃ 延伸  10 sec

第二部分 琼脂糖凝胶电泳及凝胶图谱观察

一、实验原理

DNA扩增产物带负电荷，在电场中可以由电源的负极向正极泳动，泳动的速度与DNA片断的长度成负相关，与电压强度成正比，利用这一性质可以分离不同长度的DNA片段，并可以检测PCR产物扩增情况。

由于PCR产物不能直接观察得到，所以为了检测PCR是否扩增出了目的基因，一般要进行电泳检测。在稳压电场作用下，电泳三十分钟左右。PCR产物中加入核酸荧光染料可以嵌入到DNA分子中，与DNA样品一起电泳，电泳结束后，在相应配套的观察仪中即可观察到电泳结果。

二、设备及试剂

电泳仪，水平电泳槽，移液器及吸头，烧杯，量筒，锥形瓶，琼脂糖凝胶电泳试剂盒。

实验流程：  

配胶: 将50×电泳缓冲液稀释至1×电泳缓冲液。取0.25g琼脂糖加到装有25mL 1×电泳缓冲液的150 mL三角瓶中，瓶口用封口膜封住，在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖完全熔化。

倒胶：把U型凝胶托盘放入制胶槽中，插好梳子，把配好的琼脂糖凝胶，倒入凝胶板，约15min待凝固后，拔出梳子，把凝胶点样孔一端靠负极方向，放入电泳槽中。

点样：吸取PCR反应产物10 μL转移到一个新离心管中，加入1 μL 10×Loading Buffer和1 μL核酸荧光染料充分混合，取10 μL加入点样孔内。

电泳：点样后盖好盖子，连接正负极，在80 V恒压条件下进行电泳。

三、实验结果

如图1所示，M为DNA标准分子量，1~6泳道为扩增出的相应DNA条带，用不同的核酸染料染色的结果：

背景知识：

DNA电泳一般用溴化乙锭（EB）染色，因为EB可以插入到DNA碱基对中，DNA与EB结合后，经紫外线照射，可发射出红——橙可见荧光。此方法灵敏、快速，但由于EB能够嵌入染色体碱基对，会引起基因突变，有致癌作用，所以此法不适于教学。

本实验利用花青类染料染色，不仅大大提高了染色的效率，而且提供了更加健康更加环保的实验环境。 

Loading buffer的作用：

1、指示作用：Loading buffer中含有溴酚蓝，为蓝紫色，其泳动速度比DNA快，可指示电泳进程，一般溴酚蓝泳动到胶的2/3处即可。

2、沉降作用：Loading buffer中含有蔗糖，因为蔗糖的密度大，可带着DNA下沉到点样孔中，避免DNA扩散到缓冲液中。